Immunosaostuspakkaus (Protein G -magneettihelmet)

 

Tuotteen nimi	Kissa. Ei.	Speksi.
Immunosaostuspakkaus (Protein G -magneettihelmet)	G2210-50T	50 T

 

 

IP tai Co-IP on yleinen kokeellinen tekniikka proteiinien tai proteiini-proteiinivuorovaikutusten (PPI:iden) tutkimiseen käyttämällä spesifisiä vasta-aineita ja vasta-aineita sitovaa väliainetta (esim. Protein A/G Agarose tai Protein A/G Magrose) tai suoraan käyttämällä väliaine, joka on kytketty spesifisiin vasta-aineisiin (esim. agaroosigeelit tai magneettihelmet), ja sitten eristetään antigeeni-vasta-ainekompleksit monimutkaisista proteiininäytteistä sentrifugointi tai magneettinen voima, jotta saavutetaan kohdeproteiinien eristäminen ja puhdistaminen, joita voidaan myöhemmin käyttää Western blot - tai massaspektrometriassa. Proteiini A on Staphylococcus aureuksesta löydetty soluseinän pintaproteiini, jonka molekyylipaino on 42 kDa. Proteiini G on immunoglobuliinia sitova proteiini, jota ekspressoivat tyypin C tai G streptokokkibakteerit. Proteiini A ja proteiini G ovat toiminnallisesti samanlaisia ​​ja voivat sitoutua spesifisesti nisäkkään immunoglobuliiniin (Ig). Rekombinanttiproteiini A ja G sopivalla modifikaatiolla sidottuna magneettihelmiin voidaan käyttää immunosaostukseen tai vasta-aineen puhdistamiseen. Proteiini A -magneettihelmet soveltuvat ihmisen IgG1:n, IgG2:n, IgG4:n, hiiren IgG2a:n, IgG2b:n immunosaostukseen, kun taas Protein G -magneettihelmet soveltuvat ihmisen IgG1:n, IgG2:n, IgG3:n, IgG4:n, Ig3G2:n, IgG2b1:n, IgG2b:n, IgG2b:n immunosaostukseen. , rotta IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c polyklonaaliset vasta-aineet. (Katso tarkemmat tiedot aikataulusta I)

Tämä tuote ottaa käyttöön itse kehitetyt ja tuotetut Protein A -proteiinilla leimatut magneettihelmet, verrattuna vastaaviin markkinoilla oleviin tuotteisiin, tämä tuote sitoo vasta-aineita tehokkaammin ja sillä on pienempi epäspesifinen sitoutumisnopeus, yhdessä optimoidun puskurin kanssa, se voidaan kätevä ja tehokas immunosaostuskokeissa; sitä voidaan käyttää laajasti kohdeproteiinien eristämiseen ja puhdistamiseen näytteissä, kuten solulysaateissa, soluerityksen supernatanteissa, seerumissa, askitesissa jne.; Tämä pakka tarjoaa kaksi eluointimenetelmää (denaturoiva eluutio ja happoeluointi) kohdeproteiinin eluoimiseksi, etenkään happoeluutio ei sisällä vasta-aineen kevyttä ja raskasta ketjua, mikä voi tehokkaasti ratkaista vasta-aineen raskaan ja kevyen häiriön. ketjut immunosaostus- ja proteiini-immunoblottauskokeissa.

 

 

Ominaisuudet	Kuvaus
Tuotteen sisältö	50mg/ml magneettihelmiä erityisessä suojapuskurissa
Magnetisointi	Superparamagnetismi
Yhdistetty proteiini	Proteiini G
MW proteiinia	~25 kDa (proteiini G)
Sitoutuva proteiinikapasiteetti	>1 mg hiiren vasta-ainetta per millilitra helmiä
Spesifisyys	Vasta-aineita eri lajeista, mukaan lukien hiiret, ihmiset, rotat, vuohet, lampaat ja naudat
Helmen halkaisija	30~150 μm
Eluointimenetelmät	Eluointi hapolla tai 1x SDS-PAGE-latauspuskurilla (vähennetty) Huomautus: Jos eluoidaan 1x SDS-PAGE-latauspuskurilla (vähennetty), vasta-aineen raskas ketju (~ 50 kDa) ja kevyt ketju (~ 25 kDa) denaturoituvat ja vapautuvat magneettihelmistä.
Sovellukset	IP, Co-IP, proteiinin puhdistus

 

 

Laiva märällä jäällä; 5×SDS-SIVUN latauspuskuri (pienennetty) tulee säilyttää -20 asteessa ja muut 2-8 asteessa 12 kuukauden ajan.

 

 

Komponentin numero	Komponentti	G2210-50T	Varastointilämpötila
G2038	IP-lyysipuskuri	50 ml	2-8 astetta
G0015	10 × TBS	5 ml	2-8 astetta
G2210-1	SweMagrose proteiini G	1 ml	2-8 astetta
G2209-2	Happo eluutio puskuri	10 ml	2-8 astetta
G2209-3	Neulisointi eluutio puskuri	1 ml	2-8 astetta
G2013	5x SDS-PAGE-latauspuskuri (vähennetty)	1 ml	-20 astetta
Manuaalinen		1 kpl

 

 

Tuotteen nimi	Kissa. Määrä	Speksi.
50× Cocktail-proteaasin estäjä	G2006-250UL	250 μL
PBS, 1 × (fosfaattipuskuroitu suolaliuos)	G4202-500ML	500 ml

 

 

1. Sarjan valmistelu

a) Katso alla olevaa taulukkoa ja valmistele asianmukaiset reagenssit suhteessa 100-500 μL lysaattia näytettä kohti.

Vaihe	Ratkaisu vaaditaan	Tilavuus	Tilavuus
Solujen lyysi ja valmistus	IP-lysaattia sisältävä Cocktail-proteaasi-inhibiittori	100 μL	500 μL
IP	SweMagrose proteiini G	4 μL	20 μL
Pese kolme kertaa	1 × TBS	100 μL	500μL
Happeluutio ja neutralointi	Happo eluutio puskuri	20 μL	100 μL
	Neutralointipuskuri	20 μL	100 μL
Denaturoiva eluointi	1 × SDS-SIVUN latauspuskuri (vähennetty)	20 μL	100 μL

b) IP-lysaattia sisältävän proteaasi-inhibiittorin valmistus: Katso yllä olevaa taulukkoa, käytä {{0}} μl IP-lysaattia sisältävää proteaasi-inhibiittoria 0.5-1 miljoonaa solua kohti hajoamiseen; sekoita IP-lysaatti 50x Cocktail-proteaasi-inhibiittorin kanssa (G2006-250UL on suositeltavaa) suhteessa 50:1, esimerkiksi lisää 20 μl 50x Cocktail-proteaasi-inhibiittoria 1 ml:aan IP-lysaattia ja sitten 1 ml saadaan IP-lysaattia sisältävä proteaasi-inhibiittori; Valmistettu inhibiittoria sisältävä IP-lysaatti tulee laittaa jäähauteeseen tai 4 asteeseen.

c) Huomautus: Jos immunosaostuksen kohdeproteiiniin liittyy fosforylaatio- tai asetylaatiomodifikaatiota, fosfataasin estäjä tai deasetylaasi-inhibiittori on lisättävä (itse toimitettava); IP-lysaattia sisältävä inhibiittori tulee valmistaa ennen käyttöä, eikä sitä saa jäädyttää ja säilyttää myöhempää käyttöä varten.

d) 1 × TBS:n valmistus: Laimenna 10 × TBS-puskuri erittäin puhtaalla vedellä 1 × TBS:ksi. Lisää esimerkiksi 1 ml 10×TBS-puskuria 9 ml:aan erittäin puhdasta vettä, joka on 1×TBS-puskuri, kun on sekoitettu hyvin.

e) 1 x SDS-PAGE-latauspuskurin valmistus (vähennetty): sopiva määrä 5 x SDS-PAGE-latauspuskuria (vähennetty) laimennettiin 5 kertaa ultrapuhtaalla vedellä 1 x SDS-PAGE-latauspuskurin valmistamiseksi (vähennetty); sekoita esimerkiksi 0,2 ml 5x proteiinipuskuria (vähennetty) 0,8 ml ultrapuhdasta vettä, joka on 1x SDS-PAGE-latauspuskuri (vähennetty).

2. Antigeeninäytteen valmistelu

Immunosaostus- tai immunosaostuskokeet tulee suorittaa välittömästi näytteiden hajotuksen jälkeen, jos näin ei ole, näytteet voidaan säilyttää jääkaapissa -20 asteen tai -80 asteen lämpötilassa, mutta pakastaminen ja sulattaminen voivat vaikuttaa proteiini-proteiinivuorovaikutuksiin; kaikki näytteen lyysivaiheet tulee suorittaa jäähauteessa tai 4 asteessa proteiinin hajoamisen minimoimiseksi, ja tietty määrä näytettä tulee ottaa syötteeksi tai kokonaismääräksi sen jälkeen, kun näyte on valmisteltu myöhempää havaitsemista varten Western Blot.

Kudosnäytteitä varten:

a) Kudokset tulee huuhdella esikylmällä PBS:llä ylimääräisen veren poistamiseksi perusteellisesti. Punnitse ja pilko pieniksi paloiksi homogenisaattorissa jäillä.

b) Lisää IP-lysaattia sisältävä proteaasi-inhibiittori suhteessa 100-200 μL 10-20 mg kudosta kohti tai vähennä IP-lysaatin määrää, jos tarvitaan suurempia proteiinipitoisuuksia.

c) Homogenisoi lasihomogenisaattorilla tai kädessä pidettävällä homogenisaattorilla tai käytä itse kehitettyä KZ-III-F matalalämpötilamyllyämme täydelliseen jauhamiseen.

d) Homogenaatti siirrettiin 1,5 ml:n sentrifugiputkeen, ravisteltiin ja sekoitettiin, ja sitä kylvettiin jäähauteessa 30 minuutin ajan, toistettiin puhallus pipetillä 10 minuutin välein kudossolujen täydellisen hajoamisen varmistamiseksi.

e) Sentrifugoi 12, 000 xg 5 minuuttia 4 asteessa, hävitä sakka ja ime supernatantti myöhempiä immunosaostus- tai immunosaostuskokeita varten.

Kiinnittyneet solunäytteet:

a) Tarvittaessa solut voidaan pestä 2-3 kertaa PBS:llä, viimeisellä kerralla imeä jäännösneste huolellisesti.

b) Kaavi solut solukaapimella tai trypsiini digestoi solut, jotta ne ovat täysin suspendoituneita, kerää ne 1,5 ml:n sentrifugiputkeen ja sentrifugoi 1,000 xg 5 minuuttia 4 asteessa, hävitä supernatantti kerää solusakka.

c) Lisää {{0}} μl IP-lysaattia sisältävää proteaasi-inhibiittoria 0.5-1 miljoonaa solua kohden (vastaa yhtä 6-kuoppalevyn kuoppaa); puhalla asianmukaisesti ja anna jäähauteen 3-5 min, jotta solut hajoavat täysin, eikä solujen saostumista saa olla täysin hajoamisen jälkeen; jos solujen määrä on suurempi, on suositeltavaa jakaa solut 0.5-1 miljoonaan soluun/putki täydelliseen hajoamiseen.

d) Riittävän hajoamisen jälkeen sentrifugoi 12, 000 xg 5 minuuttia 4 asteessa, hävitä sakka ja ime supernatantti myöhempiä immunosaostus- tai immunosaostuskokeita varten.

Suspensiosolunäytteille:

a) Sentrifugoi 1 000 g:llä 5 minuuttia 4 asteessa sakan keräämiseksi; tarvittaessa pese kerran PBS:llä, ime sitten jäännösneste ja vorteksoi tai pyyhkäise varovasti putken pohjaa hajottaaksesi solut mahdollisimman paljon.

b) Lisää {{0}} μl IP-lysaattia sisältävää proteaasi-inhibiittoria 0.5-1 miljoonaa solua kohden (vastaa yhtä 6-kuoppalevyn kuoppaa); puhalla asianmukaisesti ja anna jäähauteen 3-5 minuuttia solujen hajottamiseksi täysin; jos solujen määrä on suurempi, on suositeltavaa jakaa solut 0.5-1 miljoonaan soluun/putki täydelliseen hajoamiseen.

c) Jäähaude 5 min, sentrifugointi 12000 g 4 asteessa 5 min, ota supernatantti eli kokonaisproteiiniliuos, jota voidaan käyttää myöhemmissä immunosaostus- tai immunosaostuskokeissa ja niin edelleen.

Bakteeri- tai hiivanäytteille:

a) Ota 1 ml bakteeri- tai hiivaliuosta ja sentrifugoi supernatantin poistamiseksi. Tarvittaessa solut voidaan pestä kerran PBS:llä, viimeisellä kerralla imeä jäännösneste huolellisesti. Vorteksoi tai pyyhkäise varovasti putken pohjaa hajottaaksesi solut mahdollisimman paljon.

b) Lisää 100-200 μL IP-lysaattia, joka sisältää proteaasi-inhibiittoria, ja puhalla kevyesti, jotta bakteerit tai sienet hajoavat kokonaan.

c) Jäähaude 10 minuutin ajan paremman hajoamisen aikaansaamiseksi bakteerit ja hiiva voidaan pilkkoa lysotsyymillä ja seinämän rikkovalla entsyymillä (itse toimitettu), ja sitten lyysata IP-lysaatilla, joka sisältää proteaasi-inhibiittoreita.

d) Sentrifugoi 12, 000 xg 5 minuuttia 4 asteessa, hävitä sakka ja ime supernatantti myöhempiä immunosaostus- tai immunosaostuskokeita varten.

3. Magneettisten helmien valmistelu

a) Suspendoi SweMagrose Protein G -magneettihelmet varovasti uudelleen homogeenisen helmidispersion muodostamiseksi mahdollisimman paljon, lisää 20 ul hyvin sekoitettua helmidispersiota jokaista 500 ul:aa näytettä kohti, ota sopiva määrä magneettihelmiä puhdas EP-putki ja lisää 1 x TBS 0,5 ml:n lopulliseen tilavuuteen (20 ul helmidispersiota jokaista näytettä käytetään esimerkkinä seuraavissa immunosaostusvaiheissa).

b) Suspendoi magneettihelmet varovasti uudelleen, aseta magneettinen erotusteline 30 sekunniksi, poista supernatantti varovasti ja toista yllä olevat vaiheet kahdesti.

c) Magneettiset helmet suspendoitiin uudelleen 1 x TBS:ään alkuperäisen helmidispersion tilavuuden mukaan.

4. Vasta-aineen sitoutuminen SweMagrose Protein G -magneettihelmiin

a) Vasta-aineen valmistus: laimenna vasta-aine 1x TBS:llä vasta-aineen työliuoksen valmistamiseksi vasta-aineohjeissa suositellun laimennussuhteen mukaisesti tai valmista vasta-aine vasta-aineen työliuokseksi, jonka lopullinen pitoisuus on 5-50 ug/ml , joka voidaan valmistaa jäillä; valinnainen: käytä saman vasta-ainelajin normaalia IgG:tä normaalin IgG-työliuoksen valmistamiseksi samalla laimennussuhteella tai lopullisella 5-50 ug/ml konsentraatiolla, poista epäspesifinen sitoutuminen tai toimi negatiivisena kontrollina. Saman lajin normaali IgG tarkoittaa, että jos myöhemmässä immunosaostuksessa käytetty vasta-aine on hiiren IgG, sopiva määrä normaalia hiiren IgG:tä voidaan laimentaa 1x TBS:llä tässä vaiheessa taustan vähentämiseksi tai negatiivisena kontrollina.

b) Vasta-aineen adsorptio: Erottele vaiheessa 3 valmistetut SweMagrose Protein G -magneettihelmet magneeteilla, ime supernatantti, lisää 500 µl vasta-aineen työliuosta tai normaalia IgG-työliuosta, suspendoi uudelleen ja inkuboi sitten 15-60 minuuttia huoneenlämmössä. kiertosekoittimella.

Huomautus: On myös mahdollista inkuboida vaiheessa 3 valmistettuja SweMagrose Protein G -magneettihelmiä suoraan sopivan määrän vasta-ainetta tai normaalia IgG:tä kanssa.

c) Magneettinen erotus ja pesu: Erottele inkuboidut helmet magneetilla, ime supernatantti, lisää 500 µl 1×TBS:ää, suspensoi SweMagrose Protein G -helmet varovasti pipetillä puhaltamalla, aseta magneettinen erotusteline 10 s:ksi, poista supernatantti, toista pesu kolme kertaa ja suspensoi uudelleen helmiä 1 × TBS:llä sama määrä kuin alkuperäinen tilavuus.

Huomautus: Jos helmet agglomeroituvat tai hilseilevät inkuboinnin ja pesun aikana, se on normaali ilmiö eikä vaikuta koetuloksiin.

5. Immunosaostus (IP):

a) Epäspesifisen sitoutumisen poistaminen (valinnainen): vaiheessa 4 valmistettuja SweMagrose Protein G -helmiä, jotka sitovat normaalia IgG:tä, inkuboidaan näytteiden kanssa 4 asteessa 60 minuuttia ja erotetaan magneettiimulla, ja supernatantteja käytetään myöhemmät kokeet; Tämän vaiheen tarkoituksena on poistaa proteiinit, jotka sitoutuvat epäspesifisesti normaaliin IgG:hen.

b) Näytteiden inkubointi SweMagrose Protein G -helmillä, jotka on konjugoitu vasta-aineella tai normaalilla IgG:llä: lisää vasta-aineella tai normaalilla IgG:llä konjugoituja SweMagrose Protein G -helmiä suhteessa 20 ul helmisuspensiota jokaista 500 ul:aa proteiininäytettä kohti, aseta se sivulle oskilloivalla ravistelijalla tai pyörivällä sekoittimella ja inkuboi 2 tuntia huoneenlämpötilassa tai yön yli 4 asteessa.

Huomautus 1: Jos helmet agglomeroituvat tai hilseilevät inkuboinnin ja pesun aikana, se on normaali ilmiö eikä vaikuta koetuloksiin.

Huomautus 2: Vaihtoehtoisesti sopivaa määrää vasta-ainetta tai normaalia IgG:tä voidaan inkuboida näytteen kanssa 1-2 tuntia huoneenlämmössä tai yön yli 4 asteessa, minkä jälkeen voidaan lisätä 10-20 μL magneettihelmisuspensiota. ja inkuboitiin 60 minuuttia huoneenlämpötilassa.

c) Magneettinen erotus: aseta inkubaation jälkeen magneettierotustelineen päälle 10 sekunniksi supernatantin poistamiseksi.

Huomautus: Säilytä osa supernatantista immunosaostuksen vaikutuksen testaamiseksi.

d) Pesu: Lisää 500 ul 1 × TBS:ää, puhalla uudelleen suspendoituja helmiä varovasti pipetillä, aseta magneettierottimelle 10 sekunniksi supernatantin poistamiseksi ja toista pesu kolme kertaa.

Huomautus: Voit myös testata pesuliuoksen OD280-arvon määrittääksesi, onko pesu valmis. Jos OD280 on yli 0,05, pesukertojen määrää tulee lisätä vastaavasti.

6. Eluointi

Riippuen kohdeproteiinin ominaisuuksista ja myöhempien kokeiden vaatimuksista, yksi seuraavista menetelmistä voidaan valita eluointiin.

a) Denaturoiva eluutiomenetelmä: Tällä menetelmällä eluoidut näytteet soveltuvat SDS-PAGE:lle. Poista EP-putki magneettierottimesta, lisää putkeen 25 µl 1 × proteiininäytteenottopuskuria (vähennetty), kuumenna 95 asteessa 5 minuuttia ja suorita sitten magneettinen erotus supernatantin keräämiseksi Western blot -detektiota varten.

b) Happeluutio: Tällä menetelmällä eluoitu näyte säilyttää alkuperäisen biologisen aktiivisuutensa ja sitä voidaan käyttää jälkifunktionaaliseen analyysiin. Irrota EP-putki magneettierotustelineestä, lisää putkeen 20 µl happoeluointipuskuria, sekoita hyvin ja inkuboi huoneenlämmössä 10 minuuttia, suorita sitten magneettinen imuerotus, kerää supernatantti uuteen EP-putkeen ja heti lisää 2 µl neulisaatioeluointipuskuria säätämään eluoidun tuotteen pH neutraaliksi, jota voidaan käyttää jälkifunktionaaliseen analyysiin.

Huomautus: Käyttäjä voi säätää lisätyn eluointipuskurin määrää halutun tilavuuden mukaan.

 

 

1. Älä säilytä SweMagrose Protein A:ta pakkauksessa -20 asteessa tai jäädytä ja sulata toistuvasti, muuten se vaikuttaa magneettihelmien suorituskykyyn ja aiheuttaa tarpeettomia kokeellisia virheitä.

2. Lue nämä ohjeet huolellisesti ennen immunosaostuksen suorittamista.

3. Magneettinen erotuskehys magneettista erotusta varten on toimitettava itse

4. Jos immunosaostettu kohdeproteiini sisältää fosforylaatio- tai asetylaatiomodifikaatiota, sopivia fosfataasin estäjiä ja deasetylaasiestäjiä tulee toimittaa.

5. Säilytä helmet pH-arvossa 6-8, vältä nopeaa sentrifugointia, kuivaamista tai jäädyttämistä; älä altista helmiä magneettikentille pitkiä aikoja, jotka voivat aiheuttaa helmien kasaantumista.

6. Helmet on sekoitettava perusteellisesti ennen käyttöä. Sekoitustoimenpiteen tulee olla hellävaraista, eikä niitä saa altistaa voimakkaalle pyörteilylle ja ravistelulle vasta-aineen denaturoitumisen välttämiseksi.

7. Positiivisia ja negatiivisia kontrolleja (SweMagrose Mouse IgG) suositellaan immunosaostuksessa.

8. Proteiininäytteet tulee puhdistaa mahdollisimman pian keräämisen jälkeen ja asettaa aina 4 asteeseen tai jäähauteeseen proteiinien hajoamisen tai denaturoitumisen hidastamiseksi.

9. Magneettiset helmet voivat kerääntyä käytettäessä happoeluutiolla, mikä on normaali ilmiö eikä vaikuta magneettihelmien normaaliin käyttöön.

10. 10. Tämä tuote on tarkoitettu vain ammattilaisten tieteelliseen käyttöön, eikä sitä saa käyttää kliiniseen diagnoosiin tai hoitoon, ruokaan tai lääkkeisiin, eikä sitä saa säilyttää tavallisessa asunnossa.

11. Käytä sopivaa suojavaatetusta, kuten laboratoriohaalareita, suojalaseja ja käsineitä.

12. Proteiini A:n ja Proteiini G:n sitoutumiskyky eri geneeristen lähteiden ja alatyyppien vasta-aineisiin on esitetty taulukossa I.

 

Taulukko 1

Laji	Ig	Proteiini A	Proteiini G	Yhteensä Ig	Proteiini A	Proteiini G
Ihmisen	IgG1	++++	++++	Ihmisen	++++	++++
	IgG2	++++	++++	Hiiri	+++	+++
	IgG3	-	++++	Rotta	+/-	++
	IgG4	++++	++++	Kani	++++	+++
	IgA	++	-	Vuohi	-	++
	IgD	++	-	Kana	-	+
	IgE	++	-	Lehmä	++	++++
	IgM	++	-	Marsu	++++	++
Hiiri	IgG1	+	++++	Hamsteri	+	++
	IgG2a	++++	++++	Hevonen	++	++++
	IgG2b	+++	+++	Sika	+++	+++
	IgG3	++	+++	lampaat	+/-	++
	IgM	+/-	-	++++: Vahva Bing
Rotta	IgG1	-	+	++~+++: Keskitasoinen sidonta
	IgG2a	-	++++	+:Heikko sidonta
	IgG2b	-	++	+/-:Heikko tai ei sitovaa
	IgG2c	+	++	-: Ei sidontaa
	IgM	+/-	-

 

Vain tutkimuskäyttöön.

 

 

Suositut Tagit: immuunisaostuspakkaus (proteiini g magneettiset helmet), Kiinan immunosaostuspakkaus (proteiini g magneettiset helmet) valmistajat, toimittajat, tehdas