Eläinkudosten ja -solujen RNA-poistopakkaus

 

Tuotteen nimi	Kissa.Nro.	Speksi.
Eläinkudosten ja -solujen RNA-poistopakkaus	G3640-50T	50T

 

 

Kitti on laajakirjoinen pakkaus RNA:n puhdistamiseen eläinkudoksista ja viljellyistä soluista pylväsmenetelmällä. Pakkaus käyttää erityistä lyysipuskurijärjestelmää ilman orgaanisten reagenssien, kuten fenolin, kloroformin ja muiden orgaanisten reagenssien uuttamista, ja vastaavasti gDNA Eraser Spin Columnin (genomisen DNA:n poistaminen) ja RNA Spin Columnin (RNA:n sitomisen) kautta. , voidaan erottaa nopeasti 5-20 mg:sta eläinkudoksia, 106-107 juuri viljellyistä erittäin puhtaista soluista RNA, ja koko prosessi voidaan suorittaa vain 30 minuutissa. Saatua RNA:ta voidaan käyttää suoraan erilaisissa molekyylibiologisissa kokeissa, kuten Northern-blottauksessa, spot-blottauksessa, mRNA-puhdistuksessa, in vitro -translaatiossa, RNaasi-suojausmäärityksissä, RT-PCR:ssä, reaaliaikaisessa RT-PCR:ssä ja cDNA-kirjastojen rakentamisessa.

 

 

Proteinaasi K, DNaasi ja DTT-liuos tulee kuljettaa märän jään kanssa ja säilyttää -20 asteessa; Muut reagenssit toimitetaan ja säilytetään huoneenlämmössä enintään 12 kuukautta.

 

 

Komponentin numero	Komponentti	G3640-50T
G3640-1	Puskuri RL1	30 ml
G3640-2	Puskuri RW1	12 ml (lisää 18 ml vedetöntä etanolia ennen käyttöä)
G3640-3	Puskuri RW2	20 ml (lisää 80 ml vedetöntä etanolia ennen käyttöä)
G3640-4	DTT-ratkaisu	1,2 ml
G3640-5	Proteinaasi K	500 μL
G3640-6	DNAase	250 μL
G3640-7	10×DNaasipuskuri	500 μL
G3640-8	Nukleaasiton vesi	12 ml
G3640-9	gDNA pyyhekumi spin sarakkeet	50 settiä
G3640-10	RNA:n pyörityskolonnit	50 settiä
Manuaalinen		Yksi kopio

 

 

1. Jos sakka ilmestyy puskuriin RL1, lämmitä se 37 asteeseen sakka liuottamiseksi. Käytä sitä huoneenlämpötilaan jäähtymisen jälkeen.

2. Ennen käyttöä, lisää sopiva tilavuus DTT-liuosta puskuriin RL1 lopulliseen pitoisuuteen 4 % (lisää 40 μL DTT-liuosta per 1 ml puskuria RL1. Se tulee valmistaa välittömästi ennen käyttöä. Tämä seos voidaan säilyttää 4 asteessa yhden kuukauden ajan.)

3. Ennen kuin käytät puskuria RW1 ja RW2, tarkista, onko lisätty määritetty määrä 100 % etanolia.

4. Valmista 60 % isopropanolia (käyttövalmis) etukäteen uutettavan näytemäärän mukaan, esim. 4 ml nukleaasivapaata vettä (suositus G4700) 6 ml:aan isopropanolia.

5. Esijäähdytä mylly, jos jauhat pehmopaperia myllyllä.

Eri näytteiden lisääminen ja puskurin RL1 käyttö

Näytteen ensimmäinen lisäys	Puskurin RL1 käyttö
Adherentit viljellyt solut (petrimaljan halkaisija < 6 cm)	350 µL
Adherentit viljellyt solut (petrimaljan halkaisija on 6-10 cm)	600 µL
Suspensioviljellyt solut < 5 × 106	350 µL
5 × 106 - 1 × 107 suspensioviljeltyä solua	600 µL
5-20 mg eläinkudosta	500 µL

Taulukko 1 Eri näytteiden ensimmäinen lisäys ja puskurin RL1 käyttö

 

 

1. Näytteiden valmistelu

a. Eläinkudos: Siirrä 2-20 mg tuoretta tai kylmäsäilytettyä eläinkudosta tai RNAsolid Tissue RNA -stabilointiliuoksessa (suositus G3019) säilytettyä eläinkudosta 1,5 ml:n nukleaasivapaaseen putkeen tai erityiseen jauhatusputkeen, jossa on 2-3 3 mm hiontahelmet (suositus G0203-150G) ja 500 uL puskuria RL1 (vahvista että DTT on lisätty ennen käyttöä). Jauha kudos perusteellisesti homogenisoitua (jos kudosta ei homogenisoida perusteellisesti, se vaikuttaa RNA:n saantoon ja laatuun) käyttämällä kudoshomogenisaattoria (KZ-5F-3D suositeltava) alhaisessa lämpötilassa, lisää 10 µl Proteinaasi K:ta, sekoita hyvin ja inkuboi sitten 56 asteessa 10-15 min ja sentrifugoi 12,000 rpm 5 minuutin ajan 4 asteessa.

b. Siirrä 2-20 mg tuoretta tai kylmäsäilytettyä eläinkudosta tai RNAsolid Tissue RNA -stabilointiliuoksessa (suositus G3019) säilytettyä eläinkudosta 1,5 ml:n nukleaasivapaaseen putkeen tai erityiseen jauhatusputkeen, jossa on 500 ul puskuria RL1 (vahvista, että DTT-liuos on lisätty ennen käyttöä). Laita sentrifugiputki jäähauteeseen ja jauha kudos sähkömyllyllä perusteellisesti homogenisoituakseen (jos kudosta ei homogenisoida perusteellisesti, se vaikuttaa RNA:n saantoon ja laatuun). Lisää 10 µl Proteinaasi K:ta, sekoita hyvin ja inkuboi sitten 56 asteessa 10-15 min ja sentrifugoi 12,000 rpm 5 min 4 asteessa.

c. Siirrä 2-20 mg tuoretta tai kylmäsäilytettyä eläinkudosta tai RNAsolid Tissue RNA -stabilointiliuoksessa (suositus G3019) säilytettyä eläinkudosta nestetypellä esijäähdytettyyn huhmareen ja jauha kudosta survimella lisäämällä nestemäistä typpeä jatkuvasti, kunnes se on jauhettu (jos kudosta ei homogenisoida perusteellisesti, se vaikuttaa RNA:n saantoon ja laatuun). Siirrä sitten jauhettu jauhenäyte 1,5 ml:n nukleaasivapaaseen sentrifugiputkeen, joka sisältää 500 µl puskuria RL1 (varmista, että DTT-liuos on lisätty ennen käyttöä) ja sekoita toistuvasti. Lisää 10 µl Proteinaasi K:ta, sekoita hyvin ja inkuboi sitten 56 asteessa 10-15 min ja sentrifugoi 12,000 rpm 5 min 4 asteessa.

d. Suspensiosolut: Siirrä suspensioviljelysolut yhdessä viljelyväliaineen kanssa 1,5 ml:n nukleaasivapaaseen sentrifugiputkeen, sentrifugoi 1,000 rpm 5 minuuttia, kerää suspensioviljelysolut (106-107), ime varovasti ja hävitä supernatantti, lisää puskuria RL1 (suositeltu lisäys taulukossa 1) solusakkaan (vahvista, että DTT-liuoksessa on lisätty ennen käyttöä) ja pipetoi ja puhalla tasaisesti, kunnes selvää sakkaa ei enää ole. Lisää sitten 10 µL Proteinase K:ta, sekoita hyvin ja inkuboi 56 asteessa 10-15 min, sentrifugoi 12,000 rpm ja 4 astetta 5 minuuttia.

e. Kiinnittyneet solut: Poista kasvualusta soluista ja pese sitten 1 x PBS-puskurilla (pH 7,4). Lisää puskuria RL1 (suositeltu lisäys taulukossa 1) viljeltyihin soluihin (varmista, että DTT-liuos on lisätty ennen käyttöä), puhalla varovasti pipetillä, jotta solut putoavat kokonaan, ja siirrä solut sisältävä lysaatti 1,5 ml:aan. Nukleaasittomat sentrifugiputket. Lisää 10 µl Proteinaasi K:ta, sekoita hyvin ja inkuboi sitten 56 asteessa 10-15 min ja sentrifugoi 12,000 rpm 5 min 4 asteessa.

2. Siirrä eläinkudoksen tai solulysaatin supernatantti ensimmäisestä vaiheesta gDNA Eraser Spin Columniin (sakan aspiraation välttämiseksi) ja sentrifugoi 12, 000 rpm 1 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.

3. Hävitä gDNA Eraser Spin Column, säilytä suodos keräysputkessa.

4. Lisää yhtä suuri määrä 60 % isopropanolia edellä mainitun vaiheen keruuputken läpivirtaukseen (tässä vaiheessa saattaa esiintyä saostumista). Sekoita hyvin nestepipetillä.

5. Siirrä kaikki seos (mukaan lukien sakka) RNA Spin Columniin lisäämällä enintään 600 µL kerrallaan tai erissä, jos enemmän kuin 600 µL.

6. Sentrifugoi 12, 000 rpm 30 sekuntia huoneenlämmössä. Hävitä jäteneste ja aseta RNA Spin Column takaisin samaan keräysputkeen.

7. Lisää 500 µl puskuria RW1 RNA-pyörityskolonniin. Sentrifugoi 12, 000 rpm 30 sekuntia huoneenlämmössä ja hävitä jäteneste.

2. Lisää 600 µl puskuria RW2 RNA-pyörityskolonniin (lisää puskuria RW2 pitkin RNA-pyörityskolonnin putken seinämää, jotta putken seinämän jäännössuola huuhdellaan). Sentrifugoi 12, 000 rpm 30 sekuntia huoneenlämmössä ja hävitä jäteneste.

8. (Valinnainen) DNaasi-digestio: Tämän pakkauksen ja gDNA Eraser Spin Columnin reagenssit poistavat tehokkaasti suurimman osan genomisesta DNA:sta, ja uutettu RNA sisältää hyvin vähän genomista DNA:ta. Joillekin kudoksille, joilla on korkea genominen DNA-pitoisuus (esim. maksa, munuainen, perna jne.) tai myöhemmissä kokeissa, joissa on tiukemmat vaatimukset RNA:n puhtaudelle, DNaasi-digestio voidaan suorittaa selektiivisesti RNA Spin Column -adsorptiopylvään kalvolla.

a) DNaasi-reaktioliuoksen valmistus: 5 µl 10 x DNaasipuskuria, 5 µl DNaasia ja 40 µl nukleaasivapaata vettä sekoitettiin uudessa 1,5 ml:n nukleaasivapaassa sentrifugiputkessa.

b) Lisää 50 µl DNaasi-reaktioliuosta RNA-pyörityskolonnin keskelle ja anna sen seistä huoneenlämmössä 15 minuuttia.

c) Lisää 500 µl puskuria RW2 RNA-pyyhkäisykolonniin, sentrifugoi 12, 000 rpm 30 s huoneenlämpötilassa, hävitä jäteneste ja palauta kolonni keräysputkeen.

9. Toista vaihe 8.

10. Aseta RNA-pyörityskolonni keräysputkeen ja sentrifugoi 12, 000 rpm 2 minuuttia huoneenlämpötilassa jäännösnesteen poistamiseksi.

11. RNA-pyörityspylväs asetettiin uuteen 1,5 ml:n nukleaasivapaaseen sentrifugiputkeen ja jätettiin huoneenlämpötilaan 3-5 minuutiksi, jotta RNA-pyörytyskolonniin jäänyt etanoli haihtui täydellisesti.

11. Lisää 50-100 μL nukleaasivapaata vettä RNA-pyörityskolonnin keskelle. Inkuboi huoneenlämmössä 5 minuuttia. Sentrifugoi kolonnia 2 minuuttia 12, 000 rpm huoneenlämpötilassa RNA:n eluoimiseksi. Suuremman RNA-pitoisuuden saamiseksi voit myös lisätä ensimmäisen eluaatin takaisin RNA-pyörityskolonniin, antaa sen seistä 5 minuuttia huoneenlämmössä, sentrifugoida 12, 000 rpm 2 minuuttia huoneenlämmössä ja Kerää RNA uudelleen.

 

 

1. Lue tuoteopas huolellisesti ennen käyttöä.

2. Yritä käyttää mahdollisimman paljon juuri viljeltyjä soluja tai kudoksia. RNA:n kiinteä kudos RNA:n stabilointiliuosta (suositusnumero: G3019) suositellaan nopeaan RNaasi-inhibitioon ja kudosnäytteistä peräisin olevan RNA:n vakaaseen säilytykseen, jos solut tai kudokset vaativat pitkäaikaista säilytystä.

3. Turvallisuutesi ja terveytesi vuoksi käytä suojalaseja, käsineitä tai suojavaatetusta. Vältä puhetta, käytä nukleaasivapaita kärkiä, sentrifugiputkia ristikontaminaation välttämiseksi.

4. RNA:n erottamiseen elektroforeesilaitteistolla tulisi käyttää erityistä leikkauspenkkiä.

Täydentävä taulukko

Eri kudoksista ja soluista tällä pakkauksella uutetun kokonais-RNA:n määrä on esitetty alla olevassa taulukossa. Kudoksista tai soluista uutetun RNA:n saanto liittyy näytteiden tuoreuteen tai kasvutilaan.

 

Seuraava taulukko on vain viitteellinen.

Esimerkkilajit	Esimerkkinimet	RNA-saanto
Eläinten kudokset	Hiiren maksa	{} ug/10 mg
	Hiiren perna	{} ug/10 mg
	Hiiren keuhkot	10-20 ug/10 mg
	Hiiren munuainen	{} ug/10 mg
	Hiiren sydän	{} ug/10 mg
	Hiiren kateenkorva	10-20 ug/10 mg
	Hiiren aivot	5-10 ug/10 mg
	Hiiren haima	5-15 ug/10 mg
	Rotan lihas	2-4 ug/10 mg
	Mungpavun lehtiä	15-20 ug/100 mg
Solut	Hela	8-15 ug/106 solua

 

Vain tutkimuskäyttöön!

 

 

Suositut Tagit: eläinkudosten ja solujen RNA-uuttosarja, Kiinan eläinkudosten ja solujen RNA-uuttosarjan valmistajat, toimittajat, tehdas