Reactive Oxygen Species (ROS) -määrityssarja

 

Tuotteen nimi	Cat.No	Spec.
Reactive Oxygen Species (ROS) -määrityssarja	G1706-100T	100

 

 

Reaktiiviset happilajit (ROS) Assay Kit, joka tunnetaan myös nimellä ROS Assay Kit, on sarja ROS:n havaitsemiseen, joka perustuu fluoresoivaan DCFH-DA-koettimeen. DCFH-DA, joka tunnetaan myös nimellä 2',7'-dikloorifluoreseiinidiasetaatti, molekyylipaino 487,29, ei itsessään fluoresoi, se voi kulkea vapaasti solukalvon läpi. Soluihin pääsyn jälkeen DCFH voidaan hydrolysoida esteraasilla, jota esiintyy laajalti soluissa. DCFH ei läpäise solukalvoa ja jää siten loukkuun solun sisään. Solunsisäiset reaktiiviset happilajit (ROS) voivat hapettaa ei-fluoresoivan DCFH:n fluoresoivan DCF:n muodostamiseksi, ja generoidun fluoresenssisignaalin intensiteetti on verrannollinen solunsisäisen ROS:n tasoon. Solunsisäisten reaktiivisten happilajien taso voidaan epäsuorasti arvioida fluoresenssimikroskopialla, virtaussytometrillä tai laserkonfokaalimikroskopialla.

Reaktiiviset happilajit (ROS) -määrityssarja voi nopeasti ja tehokkaasti havaita solunsisäisen ROS:n erittäin herkästi ja helposti käyttää. Samaan aikaan toimitetaan ROS-positiivinen induktioreagenssi, joka voi indusoida ROS-tasoja useissa solutyypeissä lyhyessä ajassa positiivisten näytteiden saamiseksi. Kun 6-kuoppalevyn kuhunkin kuoppaan lisätyn näytteen määrä otetaan vakiolaskelmana, tämä sarja voidaan mitata noin 100 kertaa.

 

 

Kuljetus märällä jäällä; Säilytä -20 asteessa valolta suojassa, voimassa 12 kuukautta.

 

 

KomponenttiMäärä	Komponentti	G1706-100T
G1706-1	DCFH-DA anturi	100 μL
G1706-2	Reaktiivinen happipositiivinen induktori (2×)	20 ml
Käyttöohje		1 kpl

 

 

1. Valmistelu ennen koetta:

1.1. DCFH-DA-työliuoksen valmistus: DCFH-DA-työliuos valmistettiin laimentamalla DCFH-DA-koetin seerumittomalla soluväliaineella tai Earlen tasapainotetulla suolaliuoksella (G4213) suhteessa 1:1000.

1.2. (Valinnainen) ROS-positiivisen indusoijan työliuoksen valmistus: 1 × ROS-positiivisen indusoijan työliuos valmistettiin sekoittamalla ja laimentamalla ROS-positiivinen indusoija (2x) seerumittomalla soluväliaineella tai Earlen tasapainotetulla suolaliuoksella (G4213) suhteessa 1:1 äänenvoimakkuutta.

 

2. (Valinnainen) Solujen valmistelu positiiviselle kontrolliryhmälle:

2.1. Alkuperäinen alusta poistettiin kiinnittyneillä soluilla hyvässä kunnossa, ja väliaine poistettiin sentrifugoimalla;

2.2. Kiinnittyneet solut tai uudelleensuspendoidut solut peitettiin 1x reaktiivisilla happilajipositiivisilla induktorityöliuoksella ja inkuboitiin CO:ssa₂inkubaattori 37 asteessa 45 min valossa (Eri solujen herkkyys on erilainen. Jos reaktiivisten happilajien lisääntymistä ei havaita 45 minuutin stimulaation jälkeen, induktioaikaa voidaan pidentää sopivasti tai indusoijan pitoisuutta suurentaa; jos reaktiivisten happilajien lisääntyminen on liian nopeaa, voidaan induktioaikaa tai induktorin pitoisuutta pienentää sopivasti).

 

3. Kiinnittyneiden solujen reaktiivisten happilajien havaitseminen:

3.1. Solujen siemenlevy: vähintään 1 vrk etukäteen hyväkuntoiset solut kylvetään tasaisesti kuoppalevyyn tietyn tiheyden mukaisesti ja lääkkeet tai muu esikäsittely suoritetaan kokeellisten tarpeiden mukaan (siirrostustiheyden määrää solukoko, kasvunopeus ja muut tekijät sen varmistamiseksi, että solujen yhteenliittymä on 50-70 % testin aikana);

3.2. Solujen pesu: Poista soluviljelyalusta ja pese se PBS-puskurilla (G4202) 1-2 kertaa vähentääksesi seerumin, lääkkeiden ja muiden aineiden vaikutusta koetuloksiin:

3.3. Latauskoetin: Poista pesupuskuri imemällä, lisää vastaava tilavuus DCFH-DA-työliuosta alla olevan taulukon mukaisesti ja inkuboi CO:ssa.₂inkubaattori 37 asteessa 30 minuuttia valossa. Sitten DCFH-DA-työliuos aspiroitiin ja pestiin PBS-puskurilla 2-3 kertaa ylimääräisen koettimen poistamiseksi kokonaan; Lopuksi solut peitettiin PBS:llä.

 

Soluviljelylevy	Reaktiivisten happilajien havaitsemisen työliuos/kaivo
6-hyvin	1000 μL
12-hyvin	500 μL
24-hyvin	250 μL
48-hyvin	200 μL
96-hyvin	100 μL

 

3.4.ROS-detektio: Kuoppalevyllä olevat leimatut solut asetettiin suoraan fluoresenssimikroskooppiin tai konfokaalimikroskooppiin havainnointia varten. Tai digestion jälkeen solut kerättiin ja havaittiin fluoresenssispektrofotometrillä, mikrolevylukijalla, virtaussytometrillä ja muilla instrumenteilla. Kun viritysaallonpituus on 488 nm ja emissioaallonpituus 525 nm, DCF:n fluoresenssispektri on hyvin samanlainen kuin FITC:n, ja FITC:n parametrit voidaan asettaa havaitsemaan DCF.

2. Reaktiivisten happilajien havaitseminen suspensiosoluissa (koskee myös kiinnittyneitä soluja, jotka on suspendoitu uudelleen digestion ja esikäsittelyn jälkeen):

2.1. Solujen esikäsittely: Valitse hyvässä kunnossa olevat solut kokeellisten vaatimusten mukaisesti ja sentrifugoi niitä nopeudella 1000 RPM 3-5 min lääkeaineen tai muun esikäsittelyn jälkeen kokeellisten vaatimusten mukaisesti solujen keräämiseksi (solutiheys määritetään seuraavien ohjeiden mukaan ilmaisujärjestelmä, menetelmä ja kokonaismäärä, esimerkiksi solujen lukumäärä yhdessä näytteessä virtausilmaisulla ei saa olla pienempi kuin 104);

2.2. Solujen pesu: Pese 1-2 kertaa PBS-puskurilla, sentrifugoi nopeudella 1000 RPM 3-5 min supernatantin poistamiseksi ja solujen keräämiseksi;

2.3. Koettimen lataus: Lisää tietty määrä DCFH-DA-työliuosta, jotta solutiheydeksi tulee 1x105-5x105 solua/ml, ja inkuboi CO:ssa.₂inkubaattori 37 asteessa 30 minuuttia pimeässä. Ravista seosta varovasti jakson aikana 5 minuutin välein varmistaaksesi täyden kosketuksen anturin ja kennon välillä. Inkuboinnin lopussa DCFH-Da-työliuos poistettiin sentrifugoimalla nopeudella 1000 RPM 3-5 min ja pestiin 2-3 kertaa PBS-puskurilla ylimääräisten koettimien poistamiseksi riittävästi. Lopuksi solut suspendoitiin uudelleen PBS:ään.

2.4. ROS-tunnistus: Koettimella leimatut solut voidaan havaita suoraan fluoresenssispektrofotometrillä, mikrolevylukijalla, virtaussytometrillä jne. Se voidaan myös pudottaa objektilasille ja tarkkailla instrumenteilla, kuten fluoresenssi- tai konfokaalimikroskopialla. Kun viritysaallonpituus on 488 nm ja emissioaallonpituus 525 nm, DCF:n fluoresenssispektri on hyvin samanlainen kuin FITC:n, ja FITC:n parametrit voidaan asettaa havaitsemaan DCF.

 

 

1. Jos yleinen fluoresenssin intensiteetti koettimen leimauksen jälkeen on liian korkea tai liian pieni kokeen aikana, DCFH-DA-koettimen laimennussuhdetta ja inkubaatioaikaa voidaan säätää sopivasti.

2. Jos anturi ei mene soluun, se aiheuttaa korkean taustan. Puhdista se mahdollisimman pitkälle.

3. Reaktiivisten happilajien positiivista indusoijaa käytetään pääasiassa positiivisten kontrollinäytteiden induktioon. Kokeellisten tarpeiden mukaan, onko positiivinen kontrolli vai ei.

4. Jokainen solujen sentrifugointi aiheuttaa tietyn menetyksen solujen kokonaistiheyteen. Kiinnitä huomiota alkuperäisen solumäärän hallintaan, jotta lopullinen solumäärä ei ole riittävä havaitsemiseen.

5. Fluoresoivan anturin sammumisen vuoksi yritä lyhentää koettimen inkubaatiosta havaitsemiseen kuluvaa aikaa (paitsi stimulaatioaika).

6. Käytä terveytesi ja turvallisuutesi vuoksi laboratoriotakkia ja käsineitä käytön aikana.

 

Vain tutkimuskäyttöön!

 

 

Suositut Tagit: reaktiivisten happilajien (ros) määrityspakkaus, Kiina reaktiivisten happityyppien (ros) määrityssarjan valmistajat, toimittajat, tehdas