Calcein AM

 

Tuotteen nimi	Kissa.Ei.	Spec..
Calcein AM	G1728-0.1ML	0,1 ml

 

 

Calcein AM (Calcein acetoxymethyl esteri) perustuu Calceiniin, johon on lisätty asetoksimetyyliesteriryhmä (AM), mikä lisää hydrofobisuutta, joten se voi helposti tunkeutua elävien solujen kalvon läpi. Calcein AM itsessään on solua läpäisevä, ei-fluoresoiva ja hydrofobinen yhdiste, joka soluun päästyään hydrolysoituu solun endogeenisten esteraasien toimesta, jolloin muodostuu voimakkaasti negatiivisesti varautunut polaarinen kalseiinimolekyyli, joka ei voi läpäistä solukalvoa ja siten säilyy kennon sisällä, kun taas kalseiini (maksimivirityksen aallonpituus: 494 nm; suurin emissio aallonpituus: 517 nm) voi säteillä voimakasta vihreää fluoresenssia. Verrattuna muihin vastaaviin koettimiin (esim. BCECF AM ja CFDA AM), Calcein AM on tällä hetkellä yksi ihanteellisista fluoresoivista koettimista elävien solujen värjäykseen, koska sen sytotoksisuus on erittäin alhainen, sillä se ei käytännössä vaikuta solujen toimintoihin, kuten solujen lisääntymiseen tai lymfosyyttien kemotaksikseen. ja alhainen pH-herkkyys.

Koska esteraasia puuttuu kuolleista soluista, Calcein AM:ää käytetään vain elävien solujen elinkelpoisuuden testaamiseen ja lyhytaikaiseen leimaamiseen. Punainen fluoresoiva nukleiinihappoväri Propidiumjodidi (PI) ei tunkeudu elävien solujen solukalvoon, vaan se kulkee kuolleen solukalvon epäjärjestyneen alueen läpi tumaan ja upottautuu solun DNA:n kaksoiskierteeseen tuottaen punaista fluoresenssia ( viritys: 535 nm, emissio: 617 nm), joten PI värjää vain kuolleita soluja. Calcein AM:tä käytetään usein yhdessä propidiumjodidin (PI) kanssa elävien ja kuolleiden solujen samanaikaiseen kaksoisfluoresenssivärjäykseen. Koska sekä kalseiini että PI-DNA voidaan virittää 490 nm:ssä, eläviä ja kuolleita soluja voidaan tarkkailla samanaikaisesti fluoresenssimikroskopialla. 545 nm:n virityksellä voidaan havaita vain kuolleita soluja.

Calcein AM:tä voidaan käyttää useimmissa nisäkässoluissa. On osoitettu, että Calcein AM:ää voidaan käyttää joissakin kasvisoluissa, kuten Arabidopsis-juuren marginaalin kaltaisissa soluissa ja joissakin hiivoissa, kuten Pichia anomala ja Saccharomyces cerevisiae. Tietyt loiset, kuten Leishmania, eivät pääse eläviin soluihin solukalvokomponenttien vuoksi, mutta Calcein AM voi päästä loissoluihin apoptoosin alkuvaiheessa, ja siksi sitä käytetään yhdessä PI:n kanssa loisten havaitsemiseen apoptoosin alkuvaiheessa. Calcein AM ei sovellu käytettäväksi sienten ja bakteerien torjuntaan, koska niiden soluseinämät estävät Calcein AM:n pääsyn soluihin.

Kalseiini itsessään on metallin kompleksoitumisen indikaattori, ja fluoresoiva signaali sammuu, kun se kompleksoituu metalli-ionien, kuten Co:n kanssa.²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Fe³⁺ja Mn²⁺fysiologisessa pH:ssa, jolloin Calcein AM on myös vihreä fluoresoiva koetin, jota voidaan käyttää mitokondrioiden läpäisevyyden siirtymähuokosten määrittämiseen.

Tämä tuote, Calcein AM, on erittäin puhdasta ja liuotettu vedettömään DMSO:hon pitoisuutena 2 mM. Calcein AM:n yleisesti käytetty lopullinen pitoisuus on 0.1-5.0 μM. Halutumman tuloksen saamiseksi säädä Calceinin lopullinen pitoisuus sopivasti solutyypin ja kokeen todellisen tilanteen mukaan.

 

 

-20 tutkinto varastointiin ja kuljetukseen, voimassa 12 kuukautta.

 

 

Komponentti	G1728-0,1 ml
Calcein AM	0,1 ml
Manuaalinen	1 kpl

 

 

Calcein AM -värjäystyöliuos valmistettiin:

Laimenna tuote sopivalla puskurilla, kuten seerumivapaalla elatusaineella, HBSS:llä (G4203) tai PBS:llä (G4202), valmistaaksesi Calcein AM -värjäystyöliuoksen pitoisuutena. 0.1-5.0 µM.

Huomautus: Calcein AM:n lopullinen pitoisuus on suositeltavaa säätää sopivasti solutyypin ja kokeellisen todellisuuden mukaan.

 

Menettelyt

1. Fluoresenssimikroskopia- tai fluoresenssitsymografiamääritys suspensiosoluille:

a) Solut laskettiin tiettyjen käsittelyjen jälkeen koesuunnitelman mukaisesti. Ota sopivat solut ja sentrifugoi niitä 250 x g 5 minuuttia huoneenlämmössä, hävitä supernatantti ja lisää sopiva tilavuus Calcein AM -värjäystyöliuosta, jotta solutiheys on noin 1 x 10⁶/ml.

b) Inkuboi soluja 37 ºC:ssa 30-45 min, optimaalinen inkubaatioaika on erilainen eri soluille. Harkitse 30 minuuttia alkuperäisenä inkubointiaikana ja optimoi se tietyn koetilanteen mukaan saadaksesi ihanteelliset tunnistustulokset.

c) Inkuboinnin lopussa sentrifugoi 250 x g 5 minuuttia, ime supernatantti ja suspensoi solut hitaasti lisäämällä 37 ºC:ssa esilämmitettyä viljelyalustaa.

d) Toista vaihe c kahdesti tai useammin, jotta peseydytään riittävästi ja poistetaan jäljelle jäänyt värjäysliuos.

e) Vaihda tuore 37 ºC:ssa esilämmitetty elatusaine ja inkuboi 37 ºC:ssa vielä 30 minuuttia valolta suojassa varmistaaksesi, että solunsisäiset esteraasit hydrolysoivat riittävästi Calcein AM:ää tuottamaan vihreää fluoresoivaa kalceiinia.

f) Soluja sentrifugoitiin nopeudella 250 x g 5 minuuttia huoneenlämpötilassa, suurin osa elatusaineesta aspiroitiin, ja solut suspendoitiin uudelleen jäljelle jääneeseen viljelyalustaan ​​ja siivottiin, minkä jälkeen niitä tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla tai havaittiin fluoresenssilla. tsymografia. Calceinin maksimaalinen viritysaallonpituus on 494 nm ja suurin emissio aallonpituus on 514 nm. Tarvittaessa voidaan tehdä muita fluoresenssi-uudelleenvärjäyksiä, ja koko prosessia tulisi välttää valokäytöllä.

 

2. Kiinnittyneiden solujen fluoresenssimikroskopia tai fluoresenssientsyymileimausmääritys:

a) Solut ympättiin petrimaljoille, monikuoppaisille soluviljelylevyille tai solujen indeksoijalle ja käsiteltiin tietyillä tavoilla koesuunnitelman mukaisesti.

b) Imu viljelyliuos ja pese solut 1-2 kertaa PBS:llä.

c) Lisää sopiva määrä Calcein AM -värjäysliuosta ja ravista varovasti, jotta väriaine peittää kaikki solut tasaisesti. Yleensä 96-kuoppalevyn tilavuus on 100 ul per kuoppa, 24-kuoppalevy on 250 ul per kuoppa, 12-kuoppalevy on 500 ul per kuoppa ja 6- kuoppalevy on 1 ml per kuoppa.

d) Inkuboi 37 ºC:ssa 30-45 min, optimaalinen inkubaatioaika vaihtelee eri soluille. Ota 30 minuuttia alkuperäiseksi inkubaatioajaksi ja optimoi inkubaatioaika käytettyjen solujen mukaan saadaksesi ihanteellisen värjäysvaikutuksen.

e) Inkuboinnin lopussa elatusaine korvattiin tuoreella esilämmitetyllä elatusaineella 37 ºC:ssa ja inkuboitiin 37 ºC:ssa vielä 30 minuuttia valolta poissa sen varmistamiseksi, että solunsisäinen esteraasi hydrolysoi riittävästi Calcein AM:tä tuottamaan vihreää fluoresoivaa kalceiinia. .

f) Aspiroi viljelyneste, pese PBS:llä 2-3 kertaa ja lisää sitten seerumiton soluviljelyneste voidaan tarkkailla fluoresenssimikroskoopilla tai havaita fluoresoivalla entsyymimarkkerilla. Kalseinin viritysaallonpituus on 494. nm ja suurin emissioaallonpituus 514 nm, ja se voidaan haluttaessa edelleen värjätä muilla fluoresoivilla väreillä, pitää koko prosessi poissa valolta.

 

3. Virtaussytometrinen määritys:

a) Kun kiinnittyneet solut on pilkottu trypsiinillä, suspensoi solut uudelleen viljelyalustaan, suspendoi solut suoraa käyttöä varten, laske, sentrifugoi sopiva määrä soluja 250 x g 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, hävitä supernatantti ja lisää sopiva tilavuus Calcein AM -värjäystyöliuosta siten, että solut ovat yksisolususpensio ja solujen tiheys on noin 1 × 106 /ml, 1 ml kutakin näytettä kohti. HUOMAA: Soluista on valmistettava vain puskurinäyte käytettäväksi negatiivisena kontrollina virtaussytometrisessa määrityksessä. negatiivinen kontrolli virtaussytometriamääritystä varten, ja on toivottavaa pitää tämä puskuri samana kuin puskuri, jota käytetään Calcein AM -värjäystyöliuoksen valmistukseen.

b) Inkuboi 30 minuuttia 37 ºC:ssa valolta suojassa.

c) Inkuboinnin päätyttyä solut kerättiin sentrifugoimalla 250 x g 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lisää 1 ml puskuria näytettä kohti, suspensoi varovasti uudelleen ja kerää solut sentrifugoimalla 250 x g 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Huomautus: Tämä vaihe poistaa ylimääräisen väriaineen ja reagenssit, jotka voivat aiheuttaa fluoresenssin sammumisen.

d) Suspendoi solut uudelleen 400 µl:aan puskuria. Tarvittaessa voidaan tehdä myös lisävärjäys. Huomaa, että koko prosessi tulee tehdä valolta suojattuna. Värjäyksen jälkeen näytteet asetetaan jäihin ja ne voidaan havaita virtaussytometrisesti ja analysoida 1 tunnin sisällä.

e) Huomaa, että vain puskuria sisältäviä ja värjäytymättömiä solunäytteitä käytettiin virtaussytometrin negatiivisen kontrollin asettamiseen. Kalseiinin maksimiviritysaallonpituus on 494 nm ja suurin emissioaallonpituus 514 nm.

 

 

1. Kaikilla fluoresoivilla väreillä on sammumisongelmia, ja valoa on vältettävä mahdollisimman paljon fluoresenssin sammumisen hidastamiseksi.

2. Calcein AM on erittäin herkkä kosteudelle ja pyrkii hajoamaan kosteissa ympäristöissä, joten Calcein AM -liuos on suljettava tiiviisti korkilla jokaisen vedon jälkeen. On suositeltavaa säilyttää erillisissä suljetuissa pakkauksissa kerta-annoksen mukaan. Älä käytä vettä sisältäviä pipetin kärkiä.

3. Koska Calcein AM ei ole stabiili vesiliuoksissa, kuten PBS, värjäystyöliuos on valmistettava ja käytettävä nyt.

4. Viljelyalustassa oleva seerumi ja fenolipunainen vaikuttavat Calcein AM -värjäytymiseen, ja on suositeltavaa, että solut pestään riittävästi ennen Calcein AM -työliuoksen lisäämistä.

5. Kalseiini AM -leimatut solut, joilla on tasainen fluoresenssi, ovat hyvä valinta soluseurantaan ja yleiseen sytoplasmavärjäykseen, mutta se ei kuitenkaan sitoudu mihinkään ja voidaan aktiivisesti vetää solusta muutamassa tunnissa, sekä kalseiinin retentioon elävissä soluissa riippuu solutyypin ja viljelyolosuhteiden luontaisista ominaisuuksista.

6. Calcein AM -värjäystä ei saa seurata aldehydikiinnittämisellä tai kalseiini katoaa kiinnityksen aikana. Lisäksi kaikki plasmakalvon häiriöt (esim. kalkinpoistoaineet tai trypsiinikäsittely) johtavat väriaineen vuotamiseen soluista.

7. Jos Calcein AM:llä on vaikeuksia päästä soluihin, voidaan käyttää pinta-aktiivista ainetta, kuten Pluronic F127. Viljelyalustan sijasta voidaan käyttää myös Calcein AM -liuosta pitoisuutena 1/10.

8. Tämä tuote on tarkoitettu vain ammattilaisten tieteelliseen käyttöön, eikä sitä saa käyttää diagnostisiin toimenpiteisiin tai hoitoon, ruokaan tai lääkkeisiin, eikä sitä saa säilyttää tavallisessa asunnossa.

9. Turvallisuutesi ja terveytesi vuoksi käytä laboratoriotakkia ja kertakäyttökäsineitä.

 

Vain tutkimuskäyttöön!

 

 

Suositut Tagit: calcein am, Kiina calcein am valmistajat, toimittajat, tehdas