Annexin V-IF488/PI-solujen apoptoosin havaitsemispakkaus

 

Tuotteen nimi	Kissa. Ei	Speksi.
Annexin V-IF488/PI-solujen apoptoosin havaitsemispakkaus	G1513-50T	50 T
	G1513-100T	100 T

 

 

Apoptoosi on normaali fysiologinen prosessi, joka tapahtuu alkion kehityksen ja kudosten homeostaasin ylläpidon aikana ja johon liittyy monia morfologisia muutoksia, joista solukalvon menetys on yksi apoptoosin varhaisista ominaisuuksista. Normaaleissa soluissa fosfatidyyliseriini (PS) jakautuu vain solukalvon fosfolipidikaksoiskerroksen sisäpuolelle. Apoptoosin varhaisessa vaiheessa PS kuitenkin kääntyy lipidikalvon sisäpuolelta ulkopuolelle paljastaen sen solun ulkopuolelle. Anneksiini V on Ca²⁺-riippuvainen fosfolipidiä sitova proteiini, jolla on korkea affiniteetti PS:ään ja se voi sitoutua spesifisesti PS:lle altistuviin soluihin. Siksi anneksiini V:tä käytetään yhtenä indikaattorina solujen varhaisen apoptoosin havaitsemiseksi. Propidiumjodidi (PI) on nukleiinihappoväriaine, joka ei voi tunkeutua normaaleihin soluihin, joissa on ehjät solukalvot ja varhaiset apoptoottiset solut, mutta se voi tunkeutua myöhäisten apoptoottisten ja nekroottisten solujen solukalvojen läpi ja värjätä soluytimiä.

Tämä tuote käyttää fuusioproteiinia, joka koostuu IF488:sta (tehostetusta vihreästä fluoresoivasta proteiinista) ja anneksiini V:stä havaitsemiskoettimena solujen varhaisen apoptoosin havaitsemiseksi. PI:tä käytetään myös erottamaan solut nekroottisista ja myöhäisistä apoptoottisista soluista. Yhdessä anneksiini V-IF488:n ja PI:n kanssa elävät solut osoittavat negatiivista värjäytymistä (Aneksiini V-/PI-), varhaiset apoptoottiset solut osoittavat yksittäistä fluoresenssipositiivista (Aneksiini V+/PI-), kun taas myöhäiset apoptoottiset ja nekroottiset solut osoittavat kaksoisfluoresenssipositiivista ( anneksiini V+/PI+). Tämä sarja soveltuu virtaussytometriaan tai fluoresenssimikroskopiaan. Se sopii myös apoptoottisten solujen kvantitatiiviseen havaitsemiseen, koska IF488 on fuusioitu suhteessa 1:1 anneksiini V:hen.

 

 

Toimita märällä jäällä; Säilytä 2-8 asteessa valolta suojassa, voimassa 12 kuukautta.

 

 

Komponentin numero	Komponentti	G1513-50T	G1513-100T
G1513-1	Anneksiini V-IF488	250 μL	2×250 μL
G1513-2	Propidiumjodidi (PI)	250 μL	2×250 μL
G1513-3	1×Sidontapuskuri	25 ml	2 × 25 ml
Manuaalinen		1 kpl

 

 

1. Solususpensio: Ota solususpensio ja kerää solut sentrifugoimalla 500 x g 5 minuutin ajan 4 asteessa.

2. Kiinnittyneet solut: Kerää ensin soluviljelmän supernatantti. digestoi sitten solut trypsiinillä ilman EDTA:ta (suositus G4002 tai G4011), yhdistä soluviljelysupernatanttiin ja kerää solut sentrifugoimalla 500 x g 5 minuuttia 4 asteessa. Trypsiinin pilkkoutumisen ei tulisi olla liian pitkä, jotta vältetään liiallisesta ruuansulatuksesta johtuvat väärät positiiviset tulokset.

3. Pese solut kahdesti esijäähdytetyllä PBS:llä (suositus G4202) ja kerää solut sentrifugoimalla 500 x g 5 minuuttia 4 asteessa kullakin kerralla.

4. Suspendoi solut varovasti uudelleen esijäähdytetyllä 1xBinding Buffer -puskurilla ja säädä solukonsentraatioksi 1-5x10⁶/ml.

5. Lisää 5 μLofAnnexin V-EGFP ja 5 μLofPI 100 μl:aan solususpensiota, sekoita varovasti ja suojaa valolta huoneenlämmössä 8-10 min.

6. Lisää 400 µL esijäähdytettyä 1×Binding Buffer -puskuria, ravista kevyesti ja käytä virtaussytometriaa tai fluoresenssimikroskooppia havaitsemiseen 1 tunnin sisällä.

 

 

1. Virtaussytometrinen tunnistus

a) Valitse sopiva jännite ja säädä valon kompensointi virtaussytometrin analyysiä varten. on suositeltavaa asettaa negatiivinen kontrolli (ilman anneksiini V-IF488- ja PI-merkintöjä) jännitteen säätämiseksi paitsi koeryhmää varten, ja yksi standardikontrolli (vain anneksiini V-IF488:lla ja kennot, joissa on vain PI) kompensointia varten. .

b) Vertailuesimerkki virtaussytometrian havaitsemisesta ja analysoinnista: Indusoi Jurkat T-lymfoomasoluja 5 uM kamptotesiinilla 6 tunnin ajan. Viitaten yllä oleviin kokeellisiin vaiheisiin, käytä virtaussytometryä havaitsemiseen. Tulokset on esitetty seuraavassa kuvassa.

 

 

IF488:n maksimiviritysaallonpituus on 491 nm ja suurin emissioaallonpituus on 518 nm; PI-DNA-kompleksin maksimiviritysaallonpituus on 535 nm ja suurin emissioaallonpituus 615 nm. Virtaussytometrisen korrelaatioanalyysiohjelmiston avulla piirretään kaksivärinen sirontakäyrä, jossa IF488 on vaakakoordinaatissa ja PI pystykoordinaatissa. Tyypillisessä kokeessa elävät solut eivät ole fluoresoivia ja sirontapiste sijaitsee alemman vasemmassa ensimmäisessä kvadrantissa. Varhaisessa apoptoosissa olevilla soluilla on vahva vihreä fluoresenssi ja sironta on toisessa oikeassa alakulmassa. Myöhäisen vaiheen apoptoottisilla ja nekroottisilla soluilla on kaksoispunainen ja vihreä fluoresenssi, sirontapisteen ollessa oikeassa yläkulmassa kolmannessa neljänneksessä.

 

2. Fluoresenssimikroskopian tunnistus

a) Lisää objektilasille 5-10 µl Annexin V-IF488:aa ja PI-kaksoisvärjättyä solususpensiota.

b) Peitä peitinlasilla.

c) Tarkkaile kaksivärisellä suodattimella fluoresenssimikroskoopilla. Annexin V-IF488:lla on vihreä fluoresenssisignaali ja PI:llä on punainen fluoresenssisignaali. (Kun otettaessa kuvia fluoresenssimikroskoopilla, on suositeltavaa lisätä sopiva määrä anti-fluoresenssisammutustiivistettä (G1401) fluoresenssin sammutusongelmien estämiseksi)

 

 

1. Koko koeprosessia tulee käsitellä mahdollisimman hellästi solujen fragmentoitumisen välttämiseksi, mikä voi vaikuttaa koetuloksiin.

2. Solujen pesua PBS:llä ei voida jättää väliin, ja myös jäljelle jäänyt PBS tulee poistaa mahdollisimman paljon.

3. Käytettäessä trypsiiniä solujen pilkkomiseen, koetta tulee käsitellä huolellisesti ja digestioaikaa valvoa solujen keinotekoisen vaurioitumisen välttämiseksi. Jos sulatusaika on liian lyhyt, soluja on lyötävä voimakkaasti, jotta ne putoavat, mikä voi helposti aiheuttaa mekaanisia vaurioita solukalvoon; jos ruoansulatusaika on liian pitkä, myös solukalvo vaurioituu helposti ja tulokset vaikuttavat. Lisäksi EDTA:ta sisältävää trypsiiniä ei voida käyttää. EDTA vaikuttaa anneksiini V:n sitoutumiseen PS:ään.

4. Jos jotkin solut kelluvat apoptoosin stimulaation jälkeen, kerää sekä soluviljelmän supernatantti että kiinnittyneet solut tarkemman tuloksen saamiseksi.

5. Anneksiini V-IF488 ja PI ovat herkkiä valolle, vältä valoa käytön aikana. Testaus on suoritettava mahdollisimman pian reaktion päättymisen jälkeen.

6. Turvallisuutesi ja terveytesi vuoksi käytä suojalaseja, käsineitä tai suojavaatetusta.

 

Vain tutkimuskäyttöön!